qPCR ΔΔCt 相对定量分析

用途

把仪器导出的 qPCR 原始 Ct 数据，变成可直接写进论文/汇报的相对表达量结果： ΔCt → ΔΔCt → RQ = 2^(-ΔΔCt)，并给出每个技术重复的个体 RQ、fold change、置信区间与显著性，同时自动做仪器层面的质控体检。

何时使用

需要计算相对表达量 / fold change（RQ、2^-ΔΔCt）
有 QuantStudio / 7500 / CFX / LightCycler 导出的 .xls/.xlsx/.csv，或已整理成 Sample Name / Target Name / CT 三列表
需要按"内参基因 + 目标基因"归一化，并按样品分组、以组内对照（N/WT/CK）为 calibrator
需要每个技术重复的个体 RQ 值（用于 Prism / Origin 重绘，而不是只给均值）
需要顺带检查扩增异常孔（Amp Status / HIGHSD / Ct SD）与板间漂移

输入

三种任选其一：

仪器导出文件（推荐）：.xls / .xlsx / .xlsm / .csv / .tsv。脚本自动挑工作表（优先名字含 Results 的表）、自动定位表头行与 Sample / Target / Ct 三列，不依赖固定行号。
三列表 CSV：列名 Sample Name,Target Name,CT
配置文件：JSON，含 reference / target / groups / alpha / outdir / tag，适合批量或固定流程复用

必须提供的实验信息：内参基因名（如 UBQ、Actin、GAPDH）、目标基因名、 分组与组内对照样品（如 a组:对照 a-N:样品 a-N,a-2,a-14）。

快速开始

# 1) 直接分析仪器导出文件
python scripts/ddct_run.py --input 2026-09-11_ab.xls --ref UBQ --target POT \
    --groups "a组:a-N:a-N,a-2,a-14;b组:b-N:b-N,b-1,b-5" --tag ab

# 2) 分析已整理好的三列表
python scripts/ddct_run.py --input ct.csv --ref UBQ --target POT \
    --groups "GroupA:A-N:A-N,A-1;GroupB:B-N:B-N,B-1" --tag example

# 3) 用配置文件（等价写法）
python scripts/ddct_run.py --input ct.csv --config example_config.json

# 4) 命名规范时自动分组（对照 = 后缀 N / WT / CK / NC / MOCK）
python scripts/ddct_run.py --input raw.xls --ref UBQ --target POT --groups auto --tag ab

# 5) 只抽取三列、先看列定位是否正确
python scripts/extract_ct.py raw.xls --qc -o ct.csv

--groups 语法：组名:对照样品:样品1,样品2;组名2:对照2:样品1,样品2。 每组必须有各自的对照，不做跨组比较（不同板的 Ct 基线不同）。

分析流程

ΔCt      = mean(Ct_目标) − mean(Ct_内参)          同一样品内计算
ΔΔCt     = ΔCt(样品) − ΔCt(组内对照)               对照自身 ΔΔCt = 0
相对表达量 = RQ = 2^(−ΔΔCt)                         对照自身 RQ = 1
Fold change = RQ；RQ<1 时同时给出下调倍数 = 1/RQ
逐重复RQ  = 2^(−(Ct目标_i − Ct内参_i − ΔCt_对照均值))   每个技术重复一个点
SE(ΔΔCt)  = sqrt(SE_目标² + SE_内参² + SE_对照目标² + SE_对照内参²)
RQ 区间   = 2^(−(ΔΔCt ± k·SE))   k=1 给 1SE 误差棒，k=t(1−α/2, df) 给 95% CI
显著性    = Welch 近似 t 检验（自由度 Welch–Satterthwaite 合成）

完整的误差传播推导、统计假设、扩增效率校正与常见错误，见 references/method.md。

输出

| 文件 | 内容 | |---|---| | <tag>_DDCt分析结果.xlsx | 结果汇总（含 Fold change、CI95、p 值、显著性）、逐重复RQ、Prism列格式_<目标基因>、原始Ct明细、QC检查、方法说明（含柱状图） | | <tag>_结果汇总.csv | 结果汇总表 | | <tag>_逐重复RQ_宽格式.csv | 每列一个样品、每行一个技术重复 → 直接粘入 Prism / Origin 画散点或带散点柱状图 | | <tag>_逐重复RQ_长表.csv | 每个重复的 Ct目标 / Ct内参 / ΔCt / ΔΔCt / RQ，便于复核 |

结果汇总表列：分组、目标基因、样品、对照、n目标、n内参、Ct目标均值、目标SD、 Ct内参均值、内参SD、dCt、dCt_SE、ddCt、ddCt_SE、相对表达量RQ、RQ下限_1SE、RQ上限_1SE、 RQ_CI95低、RQ_CI95高、FoldChange、变化方向、下调倍数、t值、df、p值、显著性、备注。

参数

| 参数 | 默认 | 说明 | |---|---|---| | --input | 必填 | 仪器导出文件或三列表 CSV | | --ref | UBQ | 内参基因名 | | --target | POT | 目标基因名，多个用逗号分隔 | | --groups | 必填 | 组名:对照:样品1,样品2;...；填 auto 自动推断 | | --config | — | JSON 配置，命令行参数优先 | | --tag | 输入文件名 | 输出文件前缀 | | --outdir | 当前目录 | 输出目录 | | --sheet | 自动 | 指定工作表名 | | --alpha | 0.05 | 显著性水平（影响 CI 与显著性标记） | | --no-chart / --no-qc / --keep-extract | — | 关掉图表、关掉 QC 表、额外保留三列中间 CSV |

依赖

Python 3.7+，标准库即可完成 .xls / .csv 的读取与全部计算
写出 Excel 需要 openpyxl（pip install openpyxl）；缺失时自动跳过 xlsx 输出， CSV 结果照常生成
读取 .xlsx 同样依赖 openpyxl

质控清单（分析后必看）

QC检查工作表：非Amp孔数 > 0 → 该孔扩增异常；HIGHSD标记孔数 > 0 → 该样品（尤其出现在内参上时）结果不可靠；仪器CtSD均值 > 0.3 → 孔间差异大
板间一致性：板间一致性 行给出前后两半的 ΔCt 差，> 0.5 说明两块板不一致，该样品结论需谨慎或分板重算
逐重复 RQ 离散度：跨度过大（如 0.35–1.19）通常是内参不稳，而非真实生物学差异
技术重复 vs 生物学重复：仅技术重复时 p 值只反映孔间加样误差， 不能作为生物学结论的证据；结论需要 ≥3 次独立生物学重复
扩增效率：2^(-ΔΔCt) 假定效率 100%；标准曲线斜率偏离 −3.32 较多时应做效率校正

常见问题

| 症状 | 处理 | |---|---| | 找不到表头行 | 用 --sheet 指定工作表；或先用 extract_ct.py 看定位结果；必要时手工整理三列表 | | 选错工作表 / 列 | --sheet 明确指定；extract_ct.py 会打印定位到的工作表、表头行与列字母 | | 分组报错 | 报错信息会列出数据中真实存在的样品名，据此修正 --groups | | .xls 读不了 | 用 Excel/WPS 另存为 .xlsx，或先导出三列表 CSV | | 中文样品名乱码 | 另存为 .xlsx 或 UTF-8 CSV |

各仪器（QuantStudio / 7500 / CFX / LightCycler）的列名差异、别名表、QC 列含义与排错清单，见 references/instrument-formats.md。

参考文件

references/method.md — 计算与统计原理、误差传播、扩增效率校正、常见错误
references/instrument-formats.md — 仪器导出格式、列名别名、QC 列、排错
references/example.md — 可直接复现的最小示例（含预期输出与核对要点）
scripts/ddct_run.py — 主分析脚本
scripts/extract_ct.py — 三列抽取（自动定位工作表/表头/列）
scripts/xls_read.py — 纯 Python 的 .xls（OLE2 + BIFF8）读取器

结果呈现建议

向用户报告时：先给结论（哪些样品显著上下调、倍数），再给结果表，并始终附上每条重复的原始 RQ 值与质控提示（异常孔、板间漂移、样本量类型）。不要只给均值，也不要把技术重复的 p 值说成生物学差异。